Trong quá trình vừa xây dựng, vừa hoạt động, Cục Phòng thủ bờ bể đã xây dựng lực lượng tàu chiến đấu, căn cứ, cơ sở vật chất kỹ thuật, phối hợp với các quân chủng, binh chủng bạn và nhân dân ven biển bảo vệ trật tự an ninh trên biển, đảo, thềm lục địa của Tổ quốc. Bảo vệ quyền lợi quốc gia và nhân dân làm ăn trên biển, sẵn sàng đập tan mọi âm mưu hoạt động gián điệp và xâm lược của địch.

Trước nguy cơ thất bại của Chiến lược "Chiến tranh đặc biệt", Tổng thống Mỹ Giônxơn đã quyết định đẩy mạnh chiến tranh xâm lược miền Nam và chiến tranh phá hoại miền Bắc Việt Nam. Để thực hiện kế hoạch đó, đêm ngày 31/7/1964, rạng sáng 1/8/1964, tàu khu trục Maddox của Mỹ đã tiến sâu vào vùng biển Việt Nam và gây ra nhiều tội ác đối với nhân dân ta. Với ý chí quyết đánh, dám đánh và quyết tâm trừng trị kẻ xâm phạm. Ngày 2/8/1964, biên đội tàu phóng lôi: 333, 336, 339 xuất kích bất chấp sự chống trả của đối phương, cán bộ, chiến sỹ 3 tàu của Hải quân nhân dân Việt Nam (HQNDVN) đã anh dũng kiên cường đánh trả buộc tàu Ma đốc phải tháo chạy ra khỏi hải phận vùng biển miền Bắc. Lợi dụng sự kiện này, đêm ngày 4/8/1964, chính quyền Mỹ dựng lên vụ "Vịnh Bắc Bộ" vu cáo cho Hải quân Việt Nam cố ý tấn công tàu chiến Mỹ ở vùng biển quốc tế, để lấy cớ ngày 5/8/1964 dùng lực lượng không quân tập kích ác liệt vào lực lượng Hải quân Việt Nam từ Sông Gianh, Cửa Hội, Lạch Trường đến Bãi Cháy, nhằm tiêu hao lượng tàu chiến đấu, quân cảng, kho tàng, nhiên liệu của Hải quân Việt Nam.

Trong trận đầu thử lửa, Hải quân Việt Nam đã hiệp đồng chặt chẽ với bộ đội phòng không quốc gia, công an vũ trang, dân quân tự vệ các địa phương đập tan cuộc tập kích bằng Không quân của Mỹ, đã bắn rơi 8 máy bay, bắn bị thương nhiều chiếc khác, bắt sống Trung úy giặc lái Anvơrét (là phi công đầu tiên bị bắt ở miền Bắc). Chiến thắng ngày 2 và 5/8/1964 là thắng lợi có ý nghĩa về chính trị, có tiếng vang lớn trên thế giới của quân và dân Việt Nam. Ngày 2 và 5/8/1964, mãi mãi trở thành ngày truyền thống đánh thắng trận đầu của HQNDVN và của quân, dân miền Bắc.

HQNDVN cùng quân dân cả nước đánh thắng cuộc chiến tranh phá hoại bằng Không quân và Hải quân của đế quốc Mỹ, bảo vệ miền Bắc XHCN. Bắn rơi 118 máy bay, bắn chìm và bị thương 45 tàu thuyền của địch, góp phần đánh thắng chiến tranh leo thang phá hoại miền Bắc của đế quốc Mỹ. Cùng với việc sử dụng không quân và hải quân tiến hành chiến tranh phá hoại miền Bắc lần tthứ nhất, ngày 26/2/1967, đế quốc Mỹ sử dụng nhiều máy bay xuất phát từ tàu sân bay của Biên đội 77, Hạm đội 7 thực hiện chiến dịch phong tỏa thủy lôi, bom từ trường vào hầu hết hệ thống giao thông thuỷ - bộ ven biển miền Bắc. Với quyết tâm "Đánh địch mà đi, mở đường mà tiến” Hải quân Việt Nam phát huy vai trò là lực lượng nòng cốt; lực lượng đầu tiên, trực tiếp và chủ yếu trong tháo gỡ, rà phá, làm mất hiệu lực 2.400 quả thuỷ lôi, mở tuyến thông luồng bảo đảm cho tàu thuyền hoạt động, sản xuất, tiếp nhận, vận tải chi viện cho chiến trường miền Nam trên hầu hết các cửa sông, cửa biển và hải cảng; đánh bại một phương thức tác chiến chiến lược rất thâm độc của địch.

Để chi viện cho cách mạng miền Nam, cùng với Đoàn 559 mở đường Hồ Chí Minh trên dãy Trường Sơn. Đoàn 759 (tiền thân của Đoàn 125) được thành lập ngày 23/10/1961 để mở Đường Hồ Chí Minh trên biển. Trong suốt 14 năm vận chuyển chi viện cho chiến trường miền Nam, HQNDVN đã chấp nhận mọi hy sinh, gian khổ, mưu trí vượt qua các tuyến bao vây, phong toả, đối phó với từng thủ đoạn của địch; sáng tạo nhiều phương thức hoạt động độc đáo, táo bạo; hình thành nhiều tuyến, mở hàng chục bến bãi thuộc hầu hết các tỉnh ven biển miền Nam, đến tận cùng của đất nước và sát cửa ngõ Sài Gòn; vận chuyển kịp thời và đúng thời cơ hàng ngàn tấn vũ khí, đạn dược, thuốc men, hàng chục ngàn lượt người đến những chiến trường khó khăn nhất, nơi mà con đường Hồ Chí Minh trên dãy Trường Sơn chưa vươn tới được, góp phần chi viện đắc lực cho cách mạng miền Nam.

Với nhiệm vụ tấn công địch trên chiến trường sông biển miền Nam, đánh phá các căn cứ hậu cần, kho tàng, hải cảng, triệt phá các đường giao thông thủy bộ quan trọng, tạo thế bao vây quân Mỹ, ngụy trở thành một lực lượng chiến lược của lực lượng vũ trang ở miền Nam, HQNDVN được đảm nhận nhiệm vụ huấn luyện cán bộ, chiến sỹ đặc công nước chi viện cho các chiến trường và trực tiếp chiến đấu trên chiến trường Cửa Việt - Đông Hà. Trong chiến dịch mùa Xuân năm 1975, HQNDVN đã huy động đến mức cao nhất lực lượng tàu thuyền chiến đấu và vận tải để đưa gần 4.000 cán bộ, chiến sỹ đi chiến đấu và phục vụ chiến đấu, chở pháo, xe tăng, vũ khí các loại từ hậu phương miền Bắc vào chiến trường miền Nam. Dùng tàu chiến thả thủy lôi ở cửa biển Thuận An - Bán đảo Sơn Trà để chặn địch tháo chạy ra biển, góp phần tạo điều kiện để các đơn vị bộ binh giải phóng các thành phố, các tỉnh ven biển, tiếp quản căn cứ Quy Nhơn, Nha Trang, Cam Ranh; đồng thời dùng lực lượng tàu của Đoàn 125 chở đoàn Đặc công 126 và phối hợp với một bộ phận của lực lượng Quân khu V chiến đấu giải phóng quần đảo Trường Sa, góp phần vào thắng lợi vĩ đại và trọn vẹn của dân tộc.

Thực hiện nhiệm vụ trong giai đoạn cách mạng mới, HQNDVN vừa thực hiện điều chỉnh tổ chức, bố trí, sắp xếp lại lực lượng, chuyển từ nhiệm vụ huấn luyện và chiến đấu sang nhiệm vụ huấn luyện, sẵn sàng chiến đấu; vừa phải tham gia quản lý, ổn định vùng mới giải phóng, giải quyết nhiều vấn đề sau chiến tranh và làm kinh tế.